Založenie evanjelického Kolégia v Prešove vyplynulo z absencie vyššieho protestantského školstva v Uhorsku, zároveň malo byť protiváhou ku katolíckym univerzitám v Košiciach a Trnave.
Rozhodnutie o založení Kolégia padlo 18. novembra 1665 na zasadnutí hornouhorských protestantských stavov a slobodných kráľovských miest v Košiciach. Základný kameň bol položený v apríli 1666. Na stavbu prispeli rôznymi čiastkami nielen uhorskí evanjelickí magnáti, zemania či kráľovské mestá, ale aj švédsky kráľ, protestantské stavy zo Sedmohradska, či nemecké kniežatá.
Budova mala podobu trojkrídlovej stavby s dvoma podlažiami a vnútorným dvorom, z juhu(od kostola) uzatvorená múrom s bránou.
18. októbra 1667 bolo Kolégium slávnostne otvorené. Zriadené bolo ako desaťtriedne gymnázium s vyučovaním vyšších náuk a kurzom teológie a filozofie v najvyšších ročníkoch.
Prvým rektorom sa stal Dr. Samuel Pomarius z Magdeburgu(1624 – 1683).
Zároveň s ním pôsobili na škole ďalší významní učenci tej doby, napr. Michal Pancratius, Izák Caban alebo Eliáš Ladiver. K prvým a najvýznamnejším študentom patril budúci vodca protihabsburského povstania Imrich Tököli, Jonáš Bubenka (ilustrátor Komenského Orbis pictus), či barokový maliar Jakub Bogdani a i.
V roku 1670 bolo odhalené sprisahanie proti Habsburgovcom, a jedným z dôsledkov následných represií bolo aj uzatvorenie Kolégia. Pôsobenie školy v roku 1682 obnovil spomínaný Imrich Tököli. Rektorom sa stal E. Ladiver. Po porážke povstania v roku 1686 bola škola opäť uzatvorená a v roku 1687 budova skonfiškovaná, ešte v tom roku sa pri Kolégiu odohrali popravy počas prešovských súdov, známych ako Prešovské jatky, kedy od marca do septembra bolo popravených 24 evanjelikov z rôznych kútov Uhorska, zemanov a mešťanov, a ďalšie desiatky boli neprávom väznení a mučení. Na pamiatku obetí prešovských súdov bol v roku 1908 zo zbierky profesorského zboru Kolégia na severozápadnom nároží budovy inštalovaný pamätník, jeho autorom bol Béla Markupp.
V roku 1930 sa pod vežou kostola vo Svini našli pozostatky 4 obetí, tie boli 11. novembra 1930 slávnostne uložené v bočnej krypte kostola Sv. Trojice v Prešove. V roku 1995 sa pri pamätníku zastavil a pamiatke obetí poklonil pápež Ján Pavol II.
Činnosť Kolégia bola obnovená počas posledného protihabsburského povstania Františka II. Rákociho v roku 1705. Rektorom sa stal bývalý študent Ján Rezik. V roku 1710 Prešov obsadila cisárska armáda, v júni 1711 bola škola na príkaz kráľovnej Eleonóry uzavretá a budova odovzdaná jezuitom. Tí v nej zotrvali do roku 1773, kedy bol tento rád v Uhorsku zrušený, následne budova ostala v majetku štátu (uhorskej komory). Jezuiti počas opráv v roku 1713 prepojili Kolégium s kostolom nadzemnou chodbou.
Prešovským evanjelikom bolo po roku 1711 dovolené postaviť si drevenú školu a drevený kostol na predmestí, v týchto priestoroch pôsobili do roku 1783, kedy s podporu cisára Jozefa II. odkúpili Kolégium a kostol Sv.Trojice vo verejnej dražbe. V roku 1785 bola do staronových priestorov z predmestia premiestnená škola.
V roku 1804 sa škola stala Kolégiom Potiského dištriktu Evanjelickej cirkvi a. v. v Uhorsku. Nastalo obdobie nového rozkvetu, v roku 1815 sa na škole začalo vyučovať právo a neskôr aj teológia. Známymi študentmi boli napr. Jonáš Záborský, Michal M. Hodža a ďalší predstavitelia slovenského národného obrodenia, budúci predstavitelia maďarskej revolúcie Ľudovít Košút či Aristid Dessewfy.
Po revolúcii 1848/49 bola po zásahu štátnej moci činnosť Kolégia obmedzená, škola zápasila s nedostatkom financií kvôli zásahom zo strany štátnych úradov a strate mnohých donátorov, poväčšine bývalých študentov Kolégia, ktorí museli Uhorsko po revolúcii opustiť. Impulzom k novému rozmachu školy bolo rakúsko – maďarské vyrovnanie v roku 1867.
V nasledujúcom období sa Kolégium stalo mohutným ústavom, ktorý v sebe združoval plnotriedne gymnázium, teologickú akadémiu, učiteľský ústav (1873) a právnickú akadémiu (1878). V tomto období patria k najznámejším študentom Janko Jesenský, Koloman Banšel, Pavol Országh Hviezdoslav a iní.
V druhej polovici 19. storočia prebehla mohutná prestavba Kolégia, ktorá dala budove dnešnú podobu, bolo nadstavené druhé poschodie a dobudovaná Dvorana ako reprezentačný priestor a miesto uloženia Kolegiálnej knižnice.
Koniec 1. svetovej vojny a rozpad habsburskej monarchie v roku 1918 znamenal aj koniec Kolégia v dovtedajšej podobe. Právnická a teologická akadémia boli presťahované do Maďarska.
Učiteľský ústav v roku 1925, pre nedostatok financií, prevzal československý štát. Evanjelickej cirkvi a. v. na Slovensku ostalo iba gymnázium (v tom čase už pôsobiace v priestoroch nového Kolégia postaveného v rokoch 1910 – 1911). V medzivojnových rokoch sa staré Kolégium stalo sídlom biskupa Východného dištriktu Evanjelickej cirkvi a. v. na Slovensku (po premiestnení z Liptovského Mikuláša).
Kolégium patrilo Evanjelickej cirkvi do roku 1960, kedy bola budova výnosom Mestského národného výboru poštátnená pre potreby rôznych štátnych inštitúcií (knižnica, archív, škola). Po zmene politickej situácie v Československu v roku 1989 a v rámci následných reštitúcií(1992) bola budova Kolégia vrátená Evanjelickej cirkvi.
Po nutnej rekonštrukcii sa v roku 1998 Kolégium opäť stalo sídlom biskupa Východného dištriktu ECAV na Slovensku. V roku 1999 bola zrekonštruovaná Dvorana, a v roku 2010 ukončená rekonštrukcia fasády.
V Dvorane, dostavanej v roku 1887, je uložená Kolegiálna knižnica. Existenciu knižnice môžeme predpokladať už od počiatku Kolégia (1667), ale v dôsledku pomerov vtedajšej doby sa záznamy o nej nezachovali.
Základy modernej knižnice položil vtedajší rektor prešovskej školy Daniel Sartorius v roku 1731 (kedy ešte bola škola na predmestí). Ten patril aj k prvým darcom, vo svojej pozostalosti venoval škole časť kníh zo svojej súkromnej knižnice. To bol aj najčastejší spôsob rozširovania knižnice.
So systematickým rozširovaním knižnice sa začalo po roku 1785, kedy sa Kolégium presťahovalo z predmestia do pôvodných priestorov v centre Prešova. V roku 1806 bolo v knižnici evidovaných 874 zväzkov, v roku 1826 to bolo už 1650 zväzkov. Pozíciu knihovníkov poväčšine zastávali profesori Kolégia.
V roku 1833 venoval šľachtic Ján Szirmay svoju knižnicu, 14 000 zväzkov, Kolégiu ako večný depozit. K tomuto daru pripojil aj základinu, z ktorej sa mala knižnica aj ďalej dopĺňať a hradiť plat knihovníka. Táto knižnica je situovaná na galérii Dvorany. V roku 1861 bolo v knižnici (bez Szirmayovskej knižnice) 11 000 zväzkov, v roku 1885 už 15 000.
V súčasnosti knižnica obsahuje cca 60 – 70 tisíc zväzkov a je stále prístupná verejnosti.